材料与方法
(一) 实验动物及分组
同窝的SD大白鼠，体重160～180g，1.5月龄（相当于青春期），共100只，其中雌性80只，雄性20只,饲养于自然光照环境中。由上海西普尔--必凯实验动物有限公司提供。分为两组，给药组及对照组各50只，其中雌性40只，雄性10只。
（二） 药物及剂量
滋阴泻火中药方由生地、炙龟板、黄柏、知母等组成。由本院中药制剂室煎制成浓缩合剂，每ml约含生药3g。
（三） 实验室方法
1.脑片孵育 大鼠断头，迅速取出脑组织，分离内侧基底下丘脑区（含下丘脑弓状核及腹内侧核），垂直切为两片，迅速移入预先置于37°C水浴并通以95%O2 和5%CO2的0.5ml人工脑脊液[成分为（mmol/L）: NaCl 118, KCl 3, MgCl2 2，NaHCO3 24, CaCl2 1.5, Glucose 12]中孵育。孵育的脑片平衡30min后更换新的脑脊液0.5ml,再孵育30min后，收集孵育液。然后将KCl浓度升高至28mmol/L，再孵育30min后，收集孵育液。收集的样品中加入杆菌肽，以抑制氨基肽酶活性，减少肽类降解 ，然后于-70°C保存，用于GnRH测定。
2. 免疫组化 大鼠用10%水合氯醛麻醉后，开胸暴露心脏，将注射针头插入左心室，以300ml生理盐水快速冲洗后，继以0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）配制的4%多聚甲醛灌注固定0.5 h，取出全脑。再以4%多聚甲醛固定6～8 h后，先后移入20%及30%蔗糖磷酸缓冲液中，待下沉后用冰冻切片机将下丘脑部分切成35μm厚的冠状切片，按ABC法常规免疫组化染色后，用Leica图像分析处理系统，测定视前区阳性物质的积分光密度值。
3. 推挽灌流 大鼠在10%水合氯醛麻醉下，用脑立体定向仪固定头部，将推挽套管定位埋置于内侧视前区（含视前内侧核）。在清醒状态下进行灌流，用恒速灌流泵推动人工脑脊液（成分同上），以50μl/min的速度注入内侧视前区，平衡灌流30min后开始收集灌流液，每10min收集一管，连续收集3h。收集管置于冰浴内并加入杆菌肽以减少肽类降解。收集的样品于-70°C保存，用于GnRH、β-内啡肽及氨基酸递质的测定。灌流结束后，在灌流套管内注入20μl黑墨水，取出全脑，用10%多聚甲醛固定一周，在冰冻切片机上切片，观察套管位置，定位准确者可用于样品检测，定位不准者，弃去不用。
4. GnRH及β-内啡肽的放射免疫测定 上述收集的孵育液、灌流液样品中的GnRH及β-内啡肽含量均按常规放射免疫法测定。
5. 氨基酸类递质的高效液相测定 灌流液样品中的兴奋性氨基酸递质（谷氨酸，门冬氨酸）及抑制性氨基酸递质（γ氨基丁酸）的含量，采用高效液相色谱-荧光法检测，以Beckman公司Gold system软件进行梯度控制及色谱数据处理，以外标法计算样品浓度。
（四） 统计方法 数据以 ±S表示，两组间比较采用t检验。
结 果
（一）滋阴泻火中药对内侧基底下丘脑GnRH释放的影响 见表1。
表1 滋阴泻火中药对内侧基底下丘脑GnRH释放的影响( ±S)
孵育液中GnRH的含量（μg/ L）
组别 n
基础水平 激活释放
给药组 10 36.10 ± 21.23 65.21 ± 30.40*
对照组 10 34.82 ± 18.09 83.44 ± 14.38
与对照组比较，*P<0.05。
孵育液中的GnRH含量，特别是以KCl激活释放后孵育液中的GnRH含量代表下丘脑弓状核及腹内侧核GnRH的储备状况，可反映该部位GnRH合成的水平。从实验结果可见给药组GnRH的激活释放量比对照组者显著减少，说明给药组的下丘脑弓状核及腹内侧核中GnRH的储备量显著减少，提示滋阴泻火中药可抑制下丘脑GnRH的合成。
（二）滋阴泻火中药对下丘脑视前区GnRH含量的影响 见表2。
表2. 滋阴泻火中药对下丘脑视前区GnRH含量的影响( ±S)
n 积分光密度值
给药组 6 95.80±50.05*
对照组 6 160.74±58.56
与对照组比较，*P<0.05
下丘脑视前区免疫组化染色阳性物质的积分光密度值可代表视前内侧核GnRH 的含量。从实验结果可见给药组GnRH含量比对照组显著减少，提示滋阴泻火中药可抑制下丘脑视前内侧核GnRH的合成和/或促进其GnRH的释放。
（三） 滋阴泻火中药对下丘脑内侧视前区GnRH脉冲释放频率及幅度的影响 见表3
表3. 滋阴泻火中药对下丘脑视前区GnRH脉冲释放方式的影响( ±S)
n 脉冲间隔（min） 脉冲幅度 （μg/L）
（性别） 雄性 雌性 雄性 雌性
给药组 5 80.00±15.81 ≥180** 85.60±22.94* 28.31±5.88*
对照组 5 62.00±5.70 104.00±22.80 150.60±58.70 40.36±10.05
与对照组比较，* P<0.05，** P<0.01
从一系列按时间顺序的灌流液样品的检测，可反映下丘脑视前内侧核GnRH脉冲释放的频率与幅度。由实验结果可见给药组GnRH脉冲释放的幅度比对照组显著降低，在雌性大白鼠其脉冲释放的频率也明显减低，说明滋阴泻火中药可明显抑制下丘脑视前内侧核GnRH的脉冲分泌。
(四) 滋阴泻火中药对下丘脑内侧视前区氨基酸递质及β-内啡肽释放的影响 见表4。
表4. 滋阴泻火中药对视前区氨基酸递质及β-内啡肽释放的影响 （nmol/L）
组别 n 门冬氨酸 谷氨酸 γ氨基丁酸 β-内啡肽(μg/L)
雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性
给药 6 72.28± 33.10± 111.14± 76.15± 255.21± 238.79± 593.75± 619.51±
27.33* 13.34* 76.55* 46.10* 178.89* 104.13** 169.70* 195.20*
对照 6 124.20± 120.29± 274.61± 161.53± 107.74± 104.74± 349.97± 372.57±
55.00 117.01 176.87 101.75 77.95 71.81 112.04 156.24
与对照组比较，* P<0.05， ** P<0.01
可见给药组下丘脑内侧视前区门冬氨酸和谷氨酸的释放比对照组明显减少，而γ氨基丁酸及β-内啡肽的释放明显增加，说明滋阴泻火中药可使下丘脑内侧视前区兴奋性氨基酸递质的释放明显减少，而抑制性氨基酸递质的释放明显增加，并可明显促进β-内啡肽的释放。
讨 论
(一)滋阴泻火中药抑制下丘脑GnRH的合成与分泌：
下丘脑的弓状核及腹内侧核是GnRH的紧张性分泌中心，其功能活动与维持GnRH的基础分泌水平有关。而下丘脑的视前内侧核是GnRH的周期性分泌中心，其功能活动则与GnRH的周期性脉冲式的分泌有关[4]。青春发动的显著标志不仅是下丘脑GnRH基础分泌的增加，更重要的是GnRH脉冲分泌的频率和幅度的显著提高[5]。女性在青春期的后期，当血中雌二醇浓度升高到一个临界水平并持续一定时间后，即引起下丘脑GnRH脉冲分泌突然剧增，导致腺垂体LH分泌剧增，达到峰值，从而诱发卵巢排卵[6]。本实验的结果表明滋阴泻火中药对下丘脑GnRH的紧张性分泌中心及周期性分泌中心均有显著的抑制作用，不仅可明显抑制其GnRH的合成，而且使GnRH的脉冲释放也显著减少。
（二）滋阴泻火中药对下丘脑GnRH分泌的调节机制的影响：
多种中枢神经递质及神经肽均参与下丘脑GnRH合成与分泌的调节。兴奋性氨基酸递质（门冬氨酸、谷氨酸）可促进GnRH的释放，引起垂体LH分泌的增加，并参与了雌性大鼠排卵前LH峰形成的机制[7]。抑制性氨基酸递质（γ氨基丁酸）可抑制GnRH的释放，GnRH神经元受到γ氨基丁酸的紧张性抑制作用，在青春发动前及垂体LH分泌峰值出现前均出现γ氨基丁酸水平的下降[8]。β-内啡肽也可明显抑制GnRH的释放[9]。本文的结果表明滋阴泻火中药可通过抑制下丘脑GnRH周期性分泌中心兴奋性氨基酸递质的释放，促进抑制性氨基酸递质和β内啡肽的释放，从而抑制下丘脑GnRH神经元的功能活动，使GnRH的分泌减少。
（三）滋阴泻火中药治疗特发性真性性早熟的作用机理：
特发性真性性早熟患儿的下丘脑-垂体-性腺轴提前发动、功能亢进，血清FSH、LH的水平显著升高，生殖器官及性征的发育明显提前。临床上采用滋阴泻火中药可使其下丘脑-垂体-性腺轴功能亢进显著缓解，血清FSH、LH水平下降，生殖器官及性征的发育明显消退。我们曾采用定量的逆转录-聚合酶链式反应（定量的RT-PCR）方法，证实了滋阴泻火中药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH的mRNA表达水平显著下调。结合本文的结果，我们认为滋阴泻火中药可通过抑制兴奋性氨基酸递质的释放及促进抑制性氨基酸递质和β-内啡肽的释放，使下丘脑GnRH神经元的功能活动显著降低，GnRH的基因表达水平显著下调，从而使GnRH的合成及分泌明显减少，这可能是滋阴泻火中药能有效地治疗特发性真性性早熟的主要作用机理之一.
参 考 文 献
1. 蔡德培，时毓民，陆 英. 女性特发性性早熟下丘脑-垂体-卵巢轴功能及内殖器官的发育规律。中华内分泌代谢杂志，1993，9（1）：24～26
2. 蔡德培，季志英，时毓民. 性早熟女童阴虚火旺证本质的研究。中国中医基础医学杂志，1998，4（增刊）：76～78
3. 蔡德培，张炜. 补肾中药对下丘脑GnRH、垂体FSH、LH及成骨细胞BGP基因表达的调节作用。中国中医基础医学杂志，1998，4（增刊）：132～134
4. Wetsel W G, Vanenca M M, Mercanthaler I, et al. Intrinsic pulsatile secretory activity of immortalized luteinizing hormone releasing hormone secreting neurons. Proc Natl Acad Sci USA ，1992，89:4149～4153
5. Wu F C, Butler G E, Veldhuis TD. Ontogeny of pulsatile gonadotropin releasing hormone secretion from midchildhood, through puberty, to adulthood in human male: a study using deconvolution analysis and ultrasensitive immunofluorometric assay . J Clin Endocrinol Metab，1996，81:1798～1805
6. Bourguignon JP, Franchimont P. Puberty -related increase in episodic LHRH release from rat hypothalamus in vitro. Endocrinology， 1984，114:1943～1945
7. Spergel D I, Krsmanoric L Z. Glutamate modulates [Ca2+] and gonadotropin releasing hormone secretion in immortalized hypothlamic GT1-7 neurons . Neuroendocrinology ，1994，59:309～317
8. Jarry H, Hirsch B, Leonhardt S, et al. Amino acid neurotransmitter release in the preoptic area of rats during the positive feedback actions of estradiol on LH release. Neuroendocrinology，1992，56:133～140
9. 谢启文. 现代神经内分泌学。上海：上海医科大学出版社，1999，261～262
[本文发表于中国中西医结合杂志2001，21（8）595～598]
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