补肾中药对下丘脑GnRH、垂体FSH、LH及成骨细胞BGP基因表达的调节作用
发表于：2002-3-1 作者：蔡德培 访问次数：1016次
补肾中药对下丘脑GnRH、垂体FSH、LH及成骨细胞BGP基因表达的调节作用
复旦大学附属儿科医院中西医结合研究室 蔡德培 （200032）
上海帕赛克生物工程研究所基因组研究室 张 炜
摘要 目的：探讨补肾中药对下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）、腺垂体促性腺激素（FSH、LH）及成骨细胞骨钙素（BGP）基因表达的调节。方法：采用定量的逆转录-聚合酶链式反应（定量的RT-PCR）方法，观察青春期大鼠喂饲滋阴泻火或益肾填精中药后，下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP 的信使核糖核酸（mRNA）表达水平的变化。结果：滋阴泻火药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著下调。而益肾填精药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著上调。结论：补肾中药可在转录水平调节下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP基因表达，这可能是补肾中药调整性早熟患儿青春发育进程和改善骨骼发育的主要机理之一。
关键词：中药；基因表达；促性腺激素释放激素；黄体生成素；骨钙素
本课题为卫生部科研基金资助项目（课题编号98-1-172）
真性特发性性早熟患儿的下丘脑-垂体-性腺轴提前发动、功能亢进，血清促性腺激素（FSH、LH）水平显著升高。患儿的骨骼往往生长加速、成熟提前，成骨细胞的功能活动显著亢进,血清骨钙素（BGP）水平显著升高。临床上采用滋阴泻火中药可使其下丘脑-垂体-性腺轴的功能亢进显著缓解，血清FSH、LH下降，同时其成骨细胞过度亢进的功能活动被明显抑制，血清BGP 水平下降。当患儿到达正常青春期年龄后，改用益肾填精中药，则可使其下丘脑-垂体-性腺轴及成骨细胞的功能活动重新活跃，血清FSH、LH及BGP水平升高。鉴于下丘脑的促性腺激素释放激素（GnRH）、成骨细胞BGP的分子结构均为多肽，而腺垂体FSH、LH的分子结构均为糖蛋白，他们的生物合成必然受到相应基因的调控，所以补肾中药治疗后，他们在外周血中浓度的变化很可能是相应基因调控变化的结果。为此，我们采用定量的
逆转录-聚合酶链式反应（定量的RT-PCR）方法，观察实验动物喂饲滋阴泻火或益肾填精中药后，下丘脑GnRH 、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA 表达水平的变化，以探讨补肾中药对相应基因表达的影响。
材 料 与 方 法
（一）实验动物及分组：
同窝的SD种雌性大白鼠，一月龄，体重180～190（相当于青春期），共30只，分为三组，每组10只。对照组喂饲生理盐水，滋阴泻火组喂饲滋阴泻火中药合剂，益肾填精药组喂饲益肾填精中药合剂。
（二）补肾中药及剂量：
滋阴泻火中药方由生地、灸龟板、黄柏、知母等组成；益肾填精中药方由熟地、龟板胶、仙灵脾、鹿角胶等组成。由本院中药制剂室煎制成浓缩合剂，每1ml约含生药3g，每次每只大鼠用灌胃法喂饲5ml，每日一次。疗程2个月。
（三）实验方法：
各种mRNA 表达水平采用定量的RT-PCR方法测定。
1.标本制备：疗程完成时，将各组大鼠处死，立即断头取出下丘脑及垂体，同时截取包括骨骺软骨在内的一段后肢骨关节。标本置于-85℃冰箱保存。
2.总mRNA的提取：下丘脑及垂体组织经脱脂，制成匀浆，然后提取总RNA，再经 Olig dT 柱纯化mRNA后，260nm比色定量。骨骺软骨经肌肉消化液及裂解液处理后，提取总RNA，再经 Olig dT 柱纯化mRNA，然后用紫外光比色定量，比色定量的标准为光密度1 OD = 40μg/ml RNA.
3.逆转录（RT）方法：各份提取出的mRNA样品，采用六分子随机引物以AMN逆转录其所有的mRNA为cDNA，作为PCR的摸板。
4．基因扩增（PCR）方法：
（1）引物合成：采用ENTREZ软件检索出大鼠GnRH、FSH、LH及BGP的基因序列，
根据各个靶基因的保护序列分别设计上游及下游引物各一条。如表1。
表1 GnRH、FSH、LH及BGP基因扩增的引物序列
上游引物 下游引物
GnRH 5′CGAGAATTGTTGGAATGAAAGCC 3′ 5′AGCCACAGGGTTAGTTGTAAGAGGCG 3′
FSH 5′CTTGGTCTCCTCCTCCACCGCGG 3′ 5′GCCTCAGAATCCCTTTTTTCACC 3′
LH 5′CGTCTAGAGGCCTGTGTTGTGTCC 3′ 5′CATGGAAGCCAGCCCCTCAGGAA 3′
BGP 5′GACTCCAAACGGTCCACTTAACC 3′ 5′TGCAGGAGCAMCAGTTCCTACTGGCC 3′
用CHURMAN PS 250 DNA/RNA自动合成仪合成引物，引物中的一条带有 Biotin标记。
（2）反应体系的组成：25mM Tris-Hcl pH 8.9, 500mM Kcl, 2mg/ml GELTIN,引物各 200pmol, 200nM dNTPs, Tag DNA聚合酶 2U/50μl, cDNA模板 2μl/50μl。
（3）扩增条件：在PE-480 DNA扩增仪上，94℃预变性 3min，然后按94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，做25次循环，最后于72℃延伸 5min。
（4）扩增产物及其电泳检测：每个扩增产物均带有 Biotin标记。预计的 GnRH cDNA 扩增产物片段大小为390bp， FSH者为280 bp，LH者为320 bp，BGP者为370 bp。取10μl扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，出现与预计扩增产物大小相等的电泳区带者为阳性。
5．PCR产物的定量检测：
（1）探针合成：根据每个所扩增的序列分别设计出一条针对扩增产物的 DNA探针，如表2。
表2. GnRH 、FSH、 LH及 BGP基因扩增产物的探针序列
探 针
GnRH 5GGAGTATTGTTGGGGGAAGGCGAGTGTTGATTATGTAGAGAAGT 3′
FSH 5′GGGCAACCACGCGCCCTGTCGCCCGGAAAA 3′
LH 5′CGTCTAGAATTCCCCAGAAAGAAAAGTAGAAGTCATTGCTTCGAAGGA 3′
BGP 5′CGGTCGTCGACTGCAAGTTCCCGAAAACAGCGGATCTCCTACGGCAAAGGCAAC 3′
(2) 探针固定化：在Nuae 96孔酶标板上以共价方式连接手臂分子BSA，经活化后，加入探针分子，使成为载体-手臂-探针之复合物。
（3）定量检测：将PCR产物稀释100倍后，取100μl 加到已制备好有固定化探针的96孔酶标板中，55℃保温4小时，进行固-液杂交。反复洗涤后，加入Avidin-HRP，37℃反应1小时，对杂交产物进行显色反应。最后用酶标仪（ BID-RAD）读数定量检测。读出的各 cDNA扩增产物的光密度值即代表相应的各mRNA的含量。
a) 计方法：
数据以ˉx ±s表示，两组间比较采用t检验。
结 果
各组动物下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的cDNA扩增产物光密度值的比较见表3。
表3 各组动物下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的cDNA扩增产物光密度值的比较（ˉx ±s）
对照组 滋阴泻火组 益肾填精组
光 密 度 值
GnRH cDNA 0.455 ±0.008 0.416±0.013*** 0.534±0.011***
FSH cDNA 0.566 ±0.008 0.518±0.012*** 0.629±0.011***
LH cDNA 0.406 ±0.019 0.375±0.009*** 0.434±0.022**
BGP cDNA 0.433 ±0.017 0.406±0.026* 0.562±0.033***
与对照组相比：*p<0.05,** p<0.01,*** p<0.001
可见滋阴泻火药组GnRH、FSH、LH及BGP的cDNA扩增产物的含量均较对照组显著或极显著降低，说明滋阴泻火药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著下调。而益肾填精药组的GnRH、FSH、LH及BGP的cDNA扩增产物的含量均较对照组极显著增高，说明益肾填精药可使下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著上调。
讨 论
(一)补肾中药对下丘脑-垂体促性腺激素基因表达的调节作用：
真性特发性性早熟患儿的下丘脑-垂体-性腺轴提前发动、功能亢进。其血清FSH、LH及雌二醇（E2）水平较正常同龄儿显著升高，GnRH兴奋试验呈现功能亢进的特征性变化［1］。中医辩证发现患儿均具有不同程度的阴虚火旺证象，且大多十分显著。采用滋阴泻火中药治疗病情缓解后，随着临床上阴虚火旺证象的显著改善，其下丘脑-垂体-性腺轴功能亢进的程度显著好转，血清FSH、LH、E2水平下降，子宫卵巢回缩，第二性征消退［2］。本文的结果显示，滋阴泻火药可使下丘脑GnRH及腺垂体FSH、LH的mRNA表达水平显著下调。这可能是滋阴泻火药使性早熟患儿下丘脑-垂体-性腺轴功能亢进显著缓解的主要作用环节之一。当性早熟患儿到达青春期年龄后，临床上改用益肾填精中药，可使其下丘脑-垂体-性腺轴功能重新活跃，血清FSH、LH水平升高。本文的结果则显示，益肾填精药可使下丘脑GnRH及腺垂体FSH、LH的mRNA表达水平显著上调，这可能是益肾填精药使性早熟患儿在到达正常青春期年龄后下丘脑—垂体—性腺轴功能重新活跃的主要作用环节之一。
（二）补肾中药对成骨细胞骨钙素基因表达的调节作用：
真性特发性性早熟患儿骨骼生长加速、成熟提前，但由于其骨骺过早融合，故最终身高往往较矮。临床上采用滋阴泻火中药可明显减慢患儿骨骼的线性生长，延缓骨骼的成熟，从而可防止骨骺过早融合并改善最终身高［3］。进一步的研究显示，性早熟患儿体内反映成骨细胞功能活动状态的血清BGP水平较正常同龄儿显著升高，而经滋阴泻火中药治疗后，血清BGP水平显著降低［3］。本文的结果显示，滋阴泻火药可使成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著下调，这可能是滋阴泻火药抑制成骨细胞过度亢进的功能活动的主要作用环节之一。当性早熟患儿到达正常青春期年龄后，临床上改用益肾填精中药，可使其成骨细胞的功能重新活跃，血清BGP水平升高。本文的结果则显示，益肾填精药可使成骨细胞BGP的mRNA表达水平显著上调，这可能是益肾填精药使性早熟患儿成骨细胞功能重新活跃的主要作用环节之一。
综合本文的研究结果，我们认为补肾中药可在转录水平调节下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH及成骨细胞BGP的基因表达，这可能是补肾中药调整性早熟患儿青春发育进程和改善骨骼发育的主要作用机理之一。
参 考 文 献
1．蔡德培、时毓民、陆英：女性特发性性早熟下丘脑-垂体-性腺轴功能及内生殖器官的发育规律。 中华内分泌代谢杂志 ，1993，9（1）：24～26。
2．蔡德培、时毓民：性早熟女童阴虚火旺证本质的探讨。 中国中西医结合杂志， 1991，11（7）：397～399。
3．蔡德培：滋阴泻火中药改善性早熟儿童骨骼发育的作用及机理研究。 中医杂志，1997，38（10）：615～617。
[本文发表于中医杂志2002，43（3）221～223] |
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