性早熟患儿血清中环境内分泌干扰物的测定和分析

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　芦军萍     郑力行    蔡德培
　　【摘要】 目的 研究和探讨环境内分泌干扰物（EEDs）与儿童性早熟发病的关系。方法收集2004年5月-2005年9月在我院性早熟专科门诊就诊的初诊患儿79例及正常儿童42例。运用反相高效液相色谱分析法测定性早熟患儿及正常儿童血清中4-壬基酚（4-NP）、二氯二苯二氯乙烯（p,p′-DDE）、邻苯二甲酸-2-乙基己酯（DEHP）的含量。同时测定患儿子宫和卵巢体积、骨密度及血清雌二醇(E2)含量。将血清EEDs含量与靶器官的病变指标做相关性分析及多元线性回归分析。结果 每一例正常儿童血清中均检测到一定含量的p,p′-DDE(14.93 ～ 40.39ng/ml)，部分正常儿童血清中检测到一定含量的4-NP及DEHP(ND ～  6.77 ng/ml，ND ～ 17.61 ng/ml)。性早熟患儿血清中4-NP、p,p′-DDE及DEHP含量显著高于正常儿童（P < 0.01）。性早熟患儿血清中4-NP与子宫体积、卵巢体积、骨密度均呈显著正相关(r=0.394, 0.286,0.237;P < 0.01)；p,p′-DDE与子宫体积呈显著正相关(r=0.306;P < 0.01)。4-NP对子宫体积的影响强度是p,p′-DDE的1.3倍。结论 当前正常儿童也较普遍地收到环境内分泌干扰物的污染，只不过所受污染的程度比性早熟患儿较轻而已；环境内分泌干扰物的污染与儿童性早熟的发病有密切关系，是其重要的致病因素之一；不同种类的环境内分泌干扰物对靶器官的致病作用强度有所不同。
　　【关键词】 环境内分泌干扰物 性早熟 色谱法 高效液相
                                   
　　作者单位：200032 上海 复旦大学附属儿科医院（蔡德培、芦军萍）；复旦大学公共卫生学劳动卫生教研室（郑力行）
　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（30371820）

　　儿童性发育异常，特别是性早熟的发病率近年来显著增高，已成为目前最常见的小儿内分泌疾病之一。流行病学调查发现，上海地区目前儿童性早熟患病率大约为1000：10万，男女比例为1：5[1]。近年来国外有大量文献报告，洗涤剂、农药及塑料等制造业向环境排放的物质及其分解产物，可以在自然界产生一系列环境内分泌干扰物（environmental endocrine disrupters, EEDs）。当EEDs进入机体后，可以干扰内分泌激素的合成、释放、运输、代谢等过程，从而影响内分泌系统的功能，破坏机体内环境的协调和稳定。这些物质大多具有雌激素样活性，如果进入儿童机体，可与靶器官上的雌激素受体结合，引致生殖器官及骨骼的提早发育，有可能成为性早熟的致病因素之一[2]。我们通过检测性早熟患儿及正常儿童血清中的几种有代表性的EEDs（包括：洗涤剂降解产物4－NP、有机氯农药DDT的代谢产物p,p’-DDE、塑料添加剂DEHP）的含量，并同时测定患儿的子宫、卵巢体积，骨密度及血清雌二醇E2水平，通过分析对比，以探讨EEDs与儿童性早熟发病的关系。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　材料与方法
　　1.试剂
　　邻苯二甲酸-2-乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate, DEHP)(纯度≥99.0%)、二氯二苯二氯乙烯(1,1-dichloro-2,2,bis(p-chlorophenyl)ethylene, p,p′-DDE) (纯度≥99.0%)、4-壬基酚（4-nonylphenol,4-NP）（纯度≥98.5％）三种物质的标准品购自Sigma-Aldrich 公司；甲醇(HPLC级,纯度≥99.9%),天津四友生物医学技术有限公司；正己烷(纯度≥97.0%),中国医药集团上海化学试剂公司；三氟乙酸（纯度≥99.5％，TEDIA公司）。
　　2.仪器
　　HP-1100高效液相色谱仪(美国惠普公司)，二极管陈列式检测器、荧光检测器、并配有3D化学工作站;CSF-1A超声发生器(上海超声波仪器厂)；SN628放射免疫测定仪。
　　3.研究对象
　　3.1 纳入标准：收集2004年5月-2005年9月在复旦大学附属儿科医院性早熟专科门诊就诊的初诊患儿，按照《现代儿科内分泌学－基础与临床》的性早熟诊断标准[3]纳入。收集性早熟患儿79例，年龄5.8－11.9岁，女童73例，男童6例。
　　3.2 排除标准：凡由中枢神经系统、内分泌系统及生殖系统器质性病变所引致的性早熟均被排除在外。
　　3.3 对照组：选取年龄、性别与性早熟组相匹配的正常儿童作为对照，共42例，年龄6.5－11.2岁，女童38例，男童4例。
　　4. 样品采集及预处理
　　4.1 血清预处理 每例采集血清2ml，-20℃冰箱冻存，待测定。取1ml血清，加入5ml正己烷，旋涡振荡器上剧烈振荡8－10分钟后，－20℃冰冻1h，除去部分脂肪，取上层正己烷层，50℃空气泵吹干，用甲醇饱和的正己烷定容至0.1ml后取上清液20μL进样。
　　4.2 避免污染 由于邻苯二甲酸酯类物质广泛存在,为避免来塑料制品的干扰,全部实验均采用玻璃器皿。并且考虑到洗涤剂中存在4－NP，为避免污染，玻璃器皿均用重铬酸浸泡过夜,清洗干净后,置于100℃烘箱烘干。使用前再用正己烷淋洗两次。
　　5.高效液相色谱分析
　　5.1 色谱条件：Inertsil ODS-3 4.6mm×250mm 5μm色谱柱（日本GL公司）;紫外检测器(DEHP检测波长为228nm; p,p′-DDE检测波长为238nm);荧光检测器（激发波长275nm；发射波长312nm）柱温35℃;流动相甲醇：水：三氟乙酸（1000：50：1）;洗脱速度1ml/min;进样量20μl。样品保留时间：4－NP为5.2min；p,p′-DDE为7.4min；DEHP为10.5min。
　　5.2 定性分析：用4－NP、p-p’DDE、DEHP单标和混合标样测定三种物质的保留时间,样品的定性分析采用与标样的保留时间相对照的方法进行。
　　5.3 定量分析：样品处理后进行色谱分析,所得的峰面积与样品的工作曲线相比较,通过计算分别得出样品中4－NP、p-p’DDE、DEHP的实际浓度。
　　6.标准曲线和工作曲线
　　6.1 标准品的标准曲线及检测限：配制0.002、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0μg/ml 6个浓度的标准品,做浓度-峰面积标准曲线。4-NP标准曲线: Y=16.62+854.39X,ｒ=0.9988；p,p′-DDE标准曲线: Y=-1.18+693.83X,ｒ=0.9999; DEHP标准曲线:Y=-0.02+230.00X,ｒ=0.9999。在本实验条件下,ODS-3柱对4－NP、p-p’DDE、DEHP的检测下限均为 0.001μg/ml。
　　6.2 工作曲线：以血清为空白,分别加入不同浓度的标准品,测得的峰面积减去空白值(该份血清的测定值),绘制浓度-峰面积工作曲线。4-NP工作曲线为Y=30.49+655.12X,ｒ=0.9877;p,p′-DDE工作曲线为Y=3.64+697.09X,ｒ=0.9980; DEHP工作曲线为Y=5.00+284.00X,ｒ=0.9998。
　　6.3 回收率和精密度：分别取血清1ml,加入浓度为0.05、0.1、0.5μg/ml的混合标准品溶液，每个量做5份。按前述提取方法和色谱条件测定(见表1)
　　　　　　　　　表1　4-NP 、p,p′-DDE 、DEHP、的回收率与精密度         (n=5)

　　7.子宫、卵巢体积和骨密度测定
　　以Hitachi EUB 40型二维超声诊断仪测量子宫体和卵巢的的长、宽、厚径,按 (π/6×长×宽×厚)公式分别计算子宫体积和两侧卵巢的体积[4]。
　　采用SPA-4型骨矿测定仪，以241Am为放射源，测量部位为右侧挠骨中、下1/3交界处，测定骨密度[5]。
　　8.血清雌激素测定：运用放射免疫法测定性早熟患儿血清中雌二醇(estradiol,E2)含量,所用试剂盒由美国DPC公司(Diagnostic Products Corporation)提供。
　　9.统计方法：应用SSPS10.0统计软件包，分别对相应数据进行X2检验、对数转换、Pearson相关性分析及多元线性回归分析。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　结 果
　　1. 性早熟患儿和正常儿童血清中DEHP、p,p′-DDE、4-NP含量（见表2）。

　　3. 4-NP、p,p′-DDE、 DEHP在性早熟组和正常对照组血清中的构成比（见表4）。

　　由表4可以看出，性早熟患儿血清中4-NP、p,p′-DDE和DEHP的含量均显著高于正常对照组（P < 0.01）。性早熟组患儿4-NP、p,p′-DDE和DEHP的血清含量大多在0.004μg/ml、0.05μg/ml、0.02μg/ml以上。
　　4. 性早熟患儿血清中4-NP、p,p′-DDE和DEHP含量分别与子宫和卵巢容积、骨密度、血清E2含量之间的相关性分析（见表5）。

　　分别以子宫体积、卵巢体积、骨密度及E2为应变量，以三种EEDs为自变量作多元线性回归后，得到方程：
　　（1） Log（子宫体积）＝2.655＋0.341Log（4-NP）＋1.056Log（p,p′-DDE） F＝12.861，P < 0.01, 说明4-NP和 p,p′-DDE对子宫体积的影响具有统计学意义。并且4-NP和 p,p′-DDE的标准化偏回归系数分别为0.399、0.312，比较后可知，4-NP对子宫体积的影响强度约为p,p′-DDE的1.3倍。
　　（2） Log（卵巢体积）＝0.718＋0.133Log（4-NP）
　　F＝6.949，P < 0.05, 说明4-NP对卵巢体积的影响具有统计学意义。 
　　（3） Log（骨密度）＝－0.266＋0.019Log（4-NP）
　　F＝4.563，P < 0.05, 说明4-NP对骨密度的影响具有统计学意义。 
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　讨 论
　　环境内分泌干扰物（EEDs）是指环境中存在的能干扰机体内分泌系统诸环节并导致异常效应的物质。近年来国外有大量文献报告，由洗涤剂、农药及塑料等制造业向环境排放的物质及其分解产物，可在自然界产生一系列的EEDs[6]。早在1995年，美国环境与自然资源委员会就把EEDs的研究列为其五个最优先研究项目之一。EEDs所引起的一系列危害也逐渐引起中国政府重视。
　　这些物质具有一些共同的生物学特点，例如在环境中化学性质稳定,不易被生物降解；大多脂溶性强易被机体吸收，并可通过食物链在生态系统内进行生物富集而蓄积。EEDs可经某些途径，例如污染水源、食物或经皮肤吸收，被儿童的机体摄入[7]。本研究结果显示，作为对照的正常儿童，每一例血清中均检测到p,p′-DDE，64％的血清中检测到4－NP，40％的血清中检测到DEHP，说明当前正常儿童也较普遍的受到EEDs的污染，特别是受到当年大量施放的有机氯农药DDT所造成的残毒的污染更为明显，只不过所受EEDs污染的程度比性早熟患儿较轻而已。
　　EEDs大多为小分子物质，他们虽然在化学结构上与雌激素有所不同，但同样可以与靶器官上的雌激素受体结合。雌激素受体上具有多个配体结合部位，某些部位可与天然雌激素结合，而其他部位则可与多种EEDs结合。当EEDs与雌激素受体结合后，可以相互之间，也可以与天然雌激素间发挥协同作用，激发雌激素效应的产生[8]。处于发育阶段的靶器官，对EEDs的作用更为敏感，如果受到较明显的EEDs污染或受到多种EEDs的污染，则可引起靶器官的显著病变[9]。本研究的结果显示，性早熟患儿每一例血清中均检测到p,p′-DDE，86％的血清中检测到4－NP，61％的血清中检测到DEHP，且从血清中EEDs浓度的构成比来分析，性早熟患儿所受EEDs污染的程度比正常对照组儿童要严重得多。说明EEDs污染与儿童性早熟的发病有密切联系。
　　在将性早熟患儿4-NP、p,p′-DDE、DEHP的血清含量与子宫和卵巢容积、骨密度、血清E2含量作相关性分析后，结果显示：血清4－NP含量与子宫容积、卵巢容积、骨密度均呈显著正相关（P < 0.05）；血清p,p′-DDE含量与子宫容积也呈显著正相关（P < 0.05），说明4－NP和DDT对靶器官的病变有显著作用，是儿童性早熟的重要致病因素之一。多元线性回归分析的结果则显示，4－NP对子宫容积的影响强度比DDT更强，其对子宫容积的影响强度是DDT的1.3倍。说明不同种类的EEDs对性早熟靶器官致病作用的强度并不相同，有的作用更强，有的相对较弱，有的可能无明显作用。
1997年，美国国家毒物学计划研究（NTP）报告[10]中指出，4-NP具有雌激素效应，能够使雌性SD大鼠阴道开口时间提前、子宫湿重增加、动情周期延长。Lascombe [11]等发现，4-NP能够刺激MCF-7细胞增生，该物质在和雌激素受体结合后引发基因转录，从而发挥雌激素样作用。4-NP作为一种内分泌干扰物质正日益引起人们的关注，但既往对性早熟患儿血清中4-NP的检测尚无相关报道。
　　对于p,p’-DDE与性早熟发病的关系，2001年Krstevska-Konstantinova[12]等做了类似研究。通过对性早熟患儿血清的检测，发现来自发展中国家的移民或收养的患儿血清内p,p’-DDE的平均浓度要比本土患儿高10倍，提示机体可以通过胎盘或哺乳的途径暴露于有机氯农药。Balague[13]等采用转染了ERα的MCF-7细胞和转染了ERα和ERβ基因的HeLa细胞，应用p,p′-DDE进行刺激后发现细胞株增殖，也说明该物质具有雌激素样效应。
　　Colon [14]等在研究Puerto Rican（波多黎各地区）的流行性乳房早发育过程中发现，在排除其它环境激素干扰后，患儿血清中DEHP含量显著升高，考虑主要与大量进口塑料包装的食用品有关。Hashimoto [15]等通过体外细胞培养发现，DEHP能够显著刺激人类乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖，发挥雌激素效应。但迄今尚无证据表明，DEHP可以与人类子宫内膜上皮细胞上的ER竞争性结合；大鼠活体模型也没有发现这些物质能够引起子宫营养试验和阴道角质化等雌激素效应的变化[16]。我们的研究结果也显示，虽然性早熟组患儿DEHP的血清含量要高于正常儿童，但是DEHP与生殖器官的容积大小、骨密度及E2均无相关（P>0.05）。因此DEHP与性早熟发病的关系尚待进一步研究。
　　EEDs不仅能够通过与雌激素受体结合作用于生殖器官，还可以与成骨细胞膜上的雌激素受体结合，促进骨质的钙化，对骨骼发育具有一定影响[17]。并且，考虑到EEDs对卵巢的拟雌激素作用，有可能引起E2分泌增多，促进骨质钙化，从而对增加骨密度发挥间接作用。
总之，从本研究的上述结果可初步得出下列结论：当前正常儿童也较普遍地受到EEDs的污染，只不过所受污染的程度比性早熟患儿较轻而已；EEDs的污染与儿童性早熟的发病有密切关系，是其重要的致病因素之一；不同种类的EEDs对靶器官的致病作用程度有所不同。上述研究结果应当引起有关方面足够的重视，可作为有关部门制定相关产业及环保方面法制法规的客观依据，并希望能尽快制定出适合国情的有效防治方案，以避免更多的儿童受到EEDs的不良影响。
　　我们注意到，暴露于EEDs的儿童并非都发生性早熟。这一现象提示，不同个体对EEDs敏感性也不相同，这可能是由于机体基因多态性和遗传背景的差异所致。
参考文献
1.宁寿葆,主编.现代实用儿科学.上海.复旦大学出版社.2004: 823.
2.Cohen Hubal EA, Sheldon LS, Burke JM,et al. Childrens exposure assessment: a review of factors influencing Childrens exposure, and the data available to characterize and assess that exposure. Environ Health Perspect. 2000,108: 475-86.
3.曾畿生,王德芬.现代儿科内分泌学-基础与临床.上海.上海科学技术文献出版社.2001:125-34.
4. 蔡德培, 季志英, 时毓民. 滋阴泻火中药及甲地孕酮治疗女性特发性性早熟的临床研究.中国中西医结合杂志.2001,21:732-35.
5. 李嫔,蔡德培,黄玉娟. 性早熟女童骨骼发育异常的规律及滋阴泄火中药治疗的作用. 中国中西医结合杂志.2004,24: 979-82.
6.Damgaard NI, Main KM, Toppari J et al. Impact of exposure to endocrine disrupters in utero and in childhood on adult reproductio. Best Practice & Research Clinical Endocrinology and Metabolism.2002,16:289-309.
7. Landrigan P, Garg A, Droller DB. Assessing the effects of endocrine disruptors in the National Childrens Study. Environ Health Perspect. 2003,111:1678-82.
8.Tsutsui T, Barrett JC. Neoplastic transformation of cultured mammalian cells by estrogens and estrogen-like chemicals. Environ Health Perspect.1997,105:621-23.
9. Rice C, Birnbaum LS, Cogliano J et al. Exposure assessment for endocrine disruptors: some considerations in the design of studies. Environ Health Perspect, 2003,111:1683-90.
10. Final Report on the reproductive toxicity of nonylphenol. National Toxicology Program(1997),8989-30.
11.Lascombe, I, Beffa D, Rüegg U, et al. Estrogenic Activity Assessment of Environmental Chemicals Using in Vitro Assays: Identification of Two New Estrogenic Compounds. Environ Health Perspect,2000,108:621-29.
12.Krstevska-Konstantinova M,Charlier C, Craen M et al. Sexual precocity after immigration from developing countries to Belgium: evidence of previous exposure to organochlorine pesticides. Human Reproduction 2001,16:1020-1026.
13. Balaguer P, Francois F, Comunale F et al.Reporter cell lines to study the estrogenic effects of xenoestrogens[J]. Sci Total Environ. 1999,233:47-56
14. Colon I, Caro D, Bourdony CJ et al. Identification of phthalate esters in the serum of young Puerto Rican girls with premature breast development. Environ Health Perspect,2000,108:895-900.
15. Hashimoto Y, Kawaguchi M, Miyazaki K, Nakamura M. Estrogenic activity of tissue conditioners in vitro. Dent Mater. 2003,19:341-6.
16. Paganetto G, Campi F, Varani K, Piffanelli A, Giovannini G, Borea PA. Endocrine-disrupting agents on healthy human tissues. Pharmacol Toxicol. 2000,86:24-9.
17.Teilmann G, Juul A,Skakkebak NE, et al. Putative effects of endocrine disruptors on pubertal development in the human. Best Practice & Research Clinical Endocrinology and Metabolism.2002,16:105-21.
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　[本文发表于中华预防医学杂志 2006；40（2）：81-85]