中药调整性早熟儿童青春发育进程的作用机制研究
蔡德培1，陈伯英2，张炜3，李嫔1
（1. 复旦大学儿科医院，2.复旦大学医学院神经生物学教研室，3.上海帕赛克生物工程研究所，上海  200032） 

　　［摘要］目的：在临床验证了滋阴泻火与益肾填精中药能有效地调整性早熟儿童青春发育进程作用的基础上，进一步从神经内分泌调节及基因表达的角度研究所用中药调节下丘脑-垂体促性腺机能、促生长机能的作用机制。方法：给青春期大鼠分别喂饲滋阴泻火或益肾填精药后，采用神经生物学实验方法（下丘脑推挽灌流、组织匀浆、脑片孵育及免疫组化），测定下丘脑促性腺区GnRH的含量、脉冲释放的频率与幅度，以及中枢氨基酸递质、神经肽Y及β内啡肽释放的变化；采用分子生物学方法（定量逆转录-聚合酶链式反应），测定下丘脑GnRH、GHRH、SS、腺垂体FSH、LH、GH、长骨干骺端IGF1的基因表达与蛋白表达水平。　　　　　　　　　　　结果：滋阴泻火药可明显抑制下丘脑促性腺区的兴奋性氨基酸递质的释放并促进抑制性氨基酸递质、神经肽Y和β内啡肽的释放，使下丘脑GnRH神经元的功能活动降低，GnRH、FSH及LH的基因表达水平下调，同时可使下丘脑SS的基因表达上调，垂体GH及长骨干骺端IGF1的基因表达下调，从而明显抑制下丘脑-垂体的促性腺机能及促生长机能。而益肾填精药则可明显抑制下丘脑促性腺区神经肽Y的释放，使下丘脑GnRH神经元的功能活跃，GnRH、FSH及LH的基因表达上调，同时可使下丘脑SS的基因表达下调，垂体GH及长骨干骺端IGF1的基因表达上调，从而明显促进下丘脑-垂体的促性腺机能及促生长机能。结论：滋阴泻火与益肾填精中药可通过对机体神经内分泌调节机制的调整作用以及对下丘脑GnRH、SS、腺垂体FSH、LH、GH、长骨干骺端IGF1的基因转录的调整作用，有效地调节下丘脑-垂体的促性腺机能及促生长机能。这可能是所用中药可有效地调整性早熟患儿青春发育进程及改善骨骼发育的主要作用机理。
　　［关键词］ 中药；性早熟；神经递质；神经肽Y；β内啡肽；下丘脑-垂体-性腺轴；生长抑素-生长激素-胰岛素样生长因子轴
　　 Mechanism of CHM on modulating the course of puberty development in children with precocious puberty
CAI De-Pei1,CHEN Bai-Ying2,ZHANG Wei3,LI Ping1

　　(1.Pediatric Hospital Fudan University;2. Neurobiology Department of Medical Institute Fudan University; 3.Shanghai PASIC Bioengineer Institute)
　　ABSTRACT   Objective: It was researched that the mechanism of Chinese herbal medicine ( CHM ) on regulating hypothalamic-pituitary-gonadotrophic and somatotrophic function. The research was based on therapeutic effect that CHM of Zhi Yin Xie Huo (ZYXH) and Yi Shen Tian Jing(YSTJ) can modulate the course of pubertal development of children with precocious puberty. Methods: The pubertal rats were fed with CHM of ZYXH or YSTJ, and the following parameters of the rats were monitored .The content of GnRH , the frequency and amplitude of GnRH pulse releasing , and the releasing amount of aminoacid neurotransmitters , and NPY and β-endorphin in the gonadotrophic area of the hypothalamus were determined with neurobiological methods (the push-pull perfusion, the homogenate, the incubation of the brain slices, and immunohistochemistry of hypothalamus).The levels of the gene and protein expression of GnRH ,GHRH and SS in hypothalamus , FSH ,LH and GH in adenohypophyisis and IGF-1 in metaphysis were determined with molecular biological method  (real time RT-PCR ).Results: The CHM of ZYXH could reduce the activity of GnRH neurons in hypothalamus through inhibiting the release of central exciting aminoacid neurotransmitters and promoting the release of central inhibiting aminoacid nerotransmitters , NPY and  β-endorphin in gonadotrophic area of hypothalamus , the level of the GnRH, FSH & LH mRNA expression were regulated downward , while the level of SS mRNA expression in hypothalamus were regulated upward , the level of GH mRNA expression in hypophysis and IGF-1 mRNA expression in metaphysis were regulated downward , thereby it could inhibit hypothalamic-pituitary gonadotrophic  and somatotrophic function . The CHM of YSTJ could promote the activity  of GnRH neurons in hypothalamus through inhibiting the release of NPY in  gonadotrophic area of hypothalamus , the level of GnRH , FSH & LH mRNA expression were regulated upward , while the level of SS mRNA expression in hypothalamus was regulated downward , the levels  of GH mRNA expression in hypophisis and IGF-1 mRNA expression in metaphysis were regulated upward , thereby it could promote hypothalamic-pituitary gonadotrophic
　　and somatotrophic  function . Conclusion: The CHM of ZYXH and YSTJ could regulate hypothalamic-pituitary gonadotrophic and somatotrophic function through modulating the neuroendocrine regulative mechanism and the gene transcription of GnRH & SS in hypothalamus , GH ,FSH & LH in hypophysis and IGF-1 in metaphysis. It could be chief mechanism of both  CHM on successfully modulating the course of pubertal development and  ameliorating skeletal development in children with precocious puberty.
KEY WORDS   Chinese herbal medicine (CHM); Precocious Puberty ; Neurotransmitter ; NPY ; β-endorphin; Hypothalamic-pituitary-gonadal axis; SS-GH-IGF-1 axis    
　　我院近十余年来对儿童真性特发性性早熟的发病规律、诊断及治疗进行了系统的研究，制定了一套调整其青春发育进程的中药治疗方案，包括在起病时诱导其缓解，缓解后巩固并维持疗效，到达正常青春期年龄时，则促使其更好地青春发育。临床上已验证了该套方案能有效地调整患儿的青春发育进程并改善其骨骼发育。本研究系在临床已取得疗效的基础上，进一步从神经内分泌调节及基因表达的角度研究所用中药的作用机理。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　材料与方法
　　1.实验动物及分组
　　同窝的SD雌性大白鼠，1.5月龄，体重160~180g（相当于青春期），共80只。饲养于自然光照环境中。随机分为三组，实验I组喂饲中药I号，实验II组喂饲中药II号，对照组喂饲生理盐水。剂量为每日一次，每次5ml，疗程为30天。
　　2.实验室方法
　　2.1神经生物学方法
　　2.1.1下丘脑促性腺区神经递质、神经肽的检测
　　兴奋性氨基酸递质（谷氨酸、门冬氨酸）及抑制性氨基酸递质（γ氨基丁酸）采用推挽灌流及高效液相色谱法检测。
　　β内啡肽采用推挽灌流及放射免疫法检测，神经肽Y采用免疫组化法检测。
　　2.1.2下丘脑促性腺区GnRH的检测
　　GnRH周期性分泌中心（下丘脑内侧视前区）：采用推挽灌流及放射免疫法测定GnRH脉冲释放的频率与幅度；组织匀浆及放射免疫法、免疫组化法测定GnRH含量。
　　GnRH紧张性分泌中心（内侧基底下丘脑）：采用脑片孵育及放射免疫法、免疫组化法测定GnRH含量。
　　2.2分子生物学方法
　　2.2.1下丘脑GnRH mRNA采用定量RT-PCR方法检测。
　　2.2.2下丘脑GHRH mRNA、SS mRNA采用漂浮法原位杂交技术检测。
　　2.2.3 腺垂体FSH mRNA 、LH mRNA采用定量RT-PCR方法检测。
　　2.2.4 腺垂体GH mRNA、肝脏IGF1 mRNA及长骨干骺端IGF1 mRNA采用实时荧光定量RT-PCR方法检测。
　　2.2.5下丘脑SS蛋白及腺垂体GH蛋白采用免疫组化法检测。
　　3.数据处理
　　原位杂交及免疫组化的切片均采用IMS细胞图像分析系统作图像处理。所有数据均经SPSS 11.0软件处理，采用单因素方差分析法检验各组间差异。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　结         果
　　1.中药对下丘脑促性腺区神经递质释放的影响：见表1。

　　2.中药对下丘脑促性腺区神经肽Y释放及含量的影响：见表2

　　3. 中药对下丘脑促性腺区GnRH释放及含量的影响：见表3、4、5、6


　　4.中药对下丘脑GnRH、腺垂体FSH、LH基因表达的影响：见表7

　　5.中药对下丘脑SS基因表达、蛋白表达的影响：见表8、9

　　1.中药对下丘脑-垂体促性腺机能的调节作用
　　内侧基底下丘脑（包括弓状核及腹内侧核）是GnRH的紧张性分泌中心，维持GnRH分泌的基础水平，而下丘脑内侧视前区（视前内侧核）是GnRH的周期性分泌中心，其功能活动与GnRH的周期性脉冲式的分泌有关，为诱发排卵前LH峰的重要部位［1］。青春发动的显著标志不仅是下丘脑GnRH基础分泌的增加，更重要的是GnRH脉冲分泌的频率和幅度的提高［2］。女性在青春期后期，当血中E2浓度升高到一个临界水平并持续一定时间后，引起下丘脑GnRH脉冲分泌突然剧增，导致腺垂体LH分泌剧增，达到峰值，从而诱发卵巢排卵。［3］
　　多种中枢神经递质及神经肽均参与下丘脑GnRH合成与分泌的调节。兴奋性氨基酸递质（门冬氨酸、谷氨酸）可促进GnRH的释放，引起垂体LH分泌的增加，并参与了雌性大鼠排卵前LH峰形成的机制。［4］抑制性氨基酸递质（γ氨基丁酸）可抑制GnRH的释放，GnRH神经元受到γ氨基丁酸的紧张性抑制作用，在青春发动前及垂体LH分泌峰值出现前均出现γ氨基丁酸水平的下降。［5］β内啡肽也可明显抑制GnRH的释放。
　　本研究结果显示滋阴泻火药可明显抑制中枢兴奋性氨基酸递质的释放及促进抑制性氨基酸递质、神经肽Y和β内啡肽的释放，对下丘脑GnRH周期性及紧张性分泌中心均产生显著的抑制作用，使下丘脑GnRH神经元的功能活动显著降低，GnRH的基因表达水平显著下调，GnRH的合成及分泌明显减少，从而明显抑制下丘脑-垂体的促性腺机能。而益肾填精药则可明显抑制神经肽Y的释放，对下丘脑GnRH周期性及紧张性分泌中心均产生显著的促进作用，使下丘脑GnRH的神经元的功能活跃，GnRH的基因表达水平显著上调，GnRH的合成及分泌明显增加，从而明显促进下丘脑-垂体的促性腺机能。
　　2.中药对下丘脑-垂体促生长机能的调节作用
　　青春期的长骨线性生长加速是由于下丘脑-垂体-生长轴及下丘脑-垂体-性腺轴功能活跃并协同调控的结果。垂体GH合成及分泌显著增加，通过血循环，分别作用于肝细胞及长骨干骺端的软骨细胞、成骨细胞上的GH受体，合成及释放大量的IGF1。IGF1作为细胞分裂源，可刺激长骨干骺端软骨细胞的分裂增殖，同时IGF1又具有自分泌及旁分泌作用，可使局部的 IGF1进一步增多。GH可直接作用也可经 IGF1的介导，促使软骨细胞、成骨细胞的分裂增殖，胶原及硫酸黏多糖增多，并促进骨基质的矿物质沉积，加速骨形成，从而实现长骨的线性生长加速。
　　GH的合成和释放受下丘脑GHRH及SS的调控。GHRH神经元位于下丘脑的弓状核和腹内侧核，其神经纤维伸入正中隆起，分泌的GHRH通过垂体门脉系统，作用于垂体GH细胞，促进GH的合成、分泌。SS神经元的下丘脑分布广泛，对骨骼生长起调节作用的主要是位于下丘脑室周核的SS神经元，其轴突伸入到弓状核，抑制GHRH神经元的作用，从而抑制垂体GH的合成，此外，SS纤维也伸入到正中隆起，分泌的SS经垂体门脉系统，作用于垂体GH细胞，抑制GH的释放。［6、7］
　　本研究结果显示，滋阴泻火药可使下丘脑室周核SS的基因表达、蛋白表达水平显著上调，使腺垂体GH的基因表达、蛋白表达水平显著下调，使肝脏及长骨干骺端软骨细胞IGF1的基因表达也相应显著下调，从而明显抑制下丘脑-垂体-生长轴的功能；而益肾填精药则可使下丘脑室周核SS的基因表达、蛋白表达水平显著下调，使腺垂体GH的基因表达、蛋白表达水平显著上调，肝脏及长骨干骺端软骨细胞IGF1的基因表达也相应显著上调，从而明显促进下丘脑-垂体-生长轴的功能。
　　3. 研究结果表明滋阴泻火药、益肾填精药可通过对机体神经内分泌调节机制的调整作用以及对下丘脑GnRH、SS、腺垂体FSH、LH、GH、长骨干骺端IGF1的基因转录的调整作用，有效的调节下丘脑-垂体的促性腺机能及促生长机能。这可能是所用中药可有效地调整性早熟患儿青春发育进程及改善骨骼发育的主要作用机理。
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                                 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 [本文发表于中西医结合学报 2006；4（2）：166-174]